Los hongos medicinales son una fuente rica en compuestos bioactivos con aplicaciones nutracéuticas y farmacéuticas, como el lentinano, un β-glucano con propiedades inmunomoduladoras, antioxidantes y antitumorales, producido por Lentinula edodes (shiitake). La producción de este metabolito está relacionada con las condiciones de cultivo, particularmente con la composición química y balance nutricional del sustrato. Por ello, el objetivo de esta investigación fue determinar el efecto de la composición del sustrato en la concentración de lentinano en los cuerpos fructíferos de Shiitake, bajo condiciones de cultivo piloto, utilizando como sustrato base aserrín en mezcla con bagazo de malta (BM), salvado de trigo, cáscara de semilla de calabaza y cáscara haba como suplementos. El cultivo del hongo fue realizado en fermentación en fase sólida bajo condiciones controladas, con tres tratamientos (BM, CSC, CHS) y un control ( C); las variables de respuesta evaluadas fueron el tiempo de aparición de primordios, la eficiencia biológica (EB) y la producción de lentinano. Los resultados mostraron que la composición del sustrato afecta significativamente tanto el desarrollo de los cuerpos fructíferos como en la producción de lentinano. Así, la aparición temprana de primordios fue registrada en BM y C a los 36.75 ± 0.50 días, 38.50 ± 0.58 días, respectivamente; también BM alcanzó la EB mayor al 1er corte, 47.69 ± 1.06 %, y al segundo corte con 18.9 ± 0.89 %, y la producción mayor de lentinano, 3.54 ± 0.39 g lentinano/100 g de hongo seco, bajo las condiciones de este estudio. Esto demuestra el potencial del bagazo de malta mezclado con aserrín de encino como alternativa sostenible para la producción de shiitake y lentinano, contribuyendo así al desarrollo de procesos biotecnológicos más eficientes y sustentables en la industria de los hongos medicinales.