Las metaloproteasas de matriz (MMPs de matrix metalloproteinases) son enzimas dependientes de zinc que participan en la degradación y remodelación de la matriz extracelular, desempeñando funciones relevantes en diversos procesos fisiológicos y patológicos, incluyendo desarrollo tisular, embrionario, cicatrización, angiogénesis, invasión tumoral y metástasis. Entre ellas, la metaloproteasa de matriz 16 (MMP16 o MT3-MMP) pertenece al subgrupo de MMPs de membrana y presenta un dominio catalítico que contiene residuos conservados responsables de la coordinación de iones metálicos esenciales para su actividad proteolítica. A pesar de su relevancia biológica, los determinantes estructurales responsables de su actividad catalítica y estabilidad conformacional aún están poco caracterizados. El objetivo de este trabajo fue expresar, purificar y caracterizar bioquímica y funcionalmente el dominio catalítico recombinante de MMP16 humana en su forma silvestre (WT) y dos variantes obtenidas por mutagénesis dirigida en residuos clave del sitio catalítico Glu- Ala y Asp-Ala (E247A y D81A), con la finalidad de evaluar la contribución de estos residuos a la actividad enzimática y a la estabilidad estructural de la proteína. Las proteínas recombinantes se expresaron en Escherichia coli BL21 (DE3) y se optimizaron las condiciones de cultivo hasta alcanzar una densidad óptica de DO600= 0.8-1.0, seguida de la inducción con IPTG a una concentración final de 1 mM. Posteriormente, las proteínas fueron purificadas mediante cromatografía de afinidad a níquel y cromatografía de exclusión molecular, y analizadas por SDS-PAGE al 15%. Asimismo, se analizaron los perfiles cromatográficos para estimar el estado oligomérico de las proteínas purificadas, la actividad autoproteolítica y estudios de inhibición utilizando Batimastat para evaluar la funcionalidad de las variantes. Los resultados demostraron que la MMP16 tipo silvestre y la mutante E247A presentaron niveles de expresión y solubilidad comparables. Sin embargo, la sustitución del residuo glutámico catalítico provocó la pérdida de la actividad autoproteolítica y abolió la respuesta funcional al proceso catalítico, lo que confirma el papel esencial de este residuo en la activación de la molécula de agua responsable de la hidrólisis peptídica. Por otro lado, la variante D81A mostró una marcada tendencia a la agregación y dificultades en la purificación, lo que sugiere una alteración de la estabilidad conformacional del dominio catalítico. Los análisis cromatográficos indicaron, además, diferencias en el comportamiento estructural de las variantes, lo que evidencia que modificaciones puntuales en residuos conservados pueden afectar propiedades relevantes para la función enzimática. En conjunto, los resultados obtenidos demuestran que los residuos E247 y D81 desempeñan funciones complementarias dentro de MMP16: el primero participa directamente en la catálisis dependiente de zinc, mientras que el segundo contribuye principalmente a la integridad estructural del dominio catalítico. Estos hallazgos amplían el conocimiento sobre la relación estructura-función en MMP16 y proporcionan información experimental valiosa para futuros estudios estructurales, funcionales y de diseño racional de inhibidores selectivos dirigidos a esta metaloproteasa.