Introducción: la calostroterapia es una intervención inmunomoduladora segura, accesible y de bajo costo para el cuidado del recién nacido hospitalizado, especialmente en prematuros y neonatos críticamente enfermos. A pesar de sus beneficios potenciales, su aplicación clínica continúa mostrando variabilidad en componentes operativos esenciales como la vía, el método, la dosis, la frecuencia y la duración, lo que evidencia la ausencia de criterios estandarizados en distintas unidades neonatales. Objetivo: diseñar y validar un instrumento que permita evaluar el nivel de conocimiento, el grado de implementación y la variabilidad técnica de la calostroterapia en unidades neonatales, a fin de fundamentar el desarrollo de un manual para su estandarización. Metodología: estudio cuantitativo, descriptivo y transversal, con muestreo no probabilístico por conveniencia. Se diseñó un cuestionario y se evaluó su validez de contenido mediante el método de Lawshe modificado por Tristan-Lopez, considerando claridad, coherencia y relevancia. Posteriormente, se aplicó a 107 profesionales de la salud de las áreas de enfermería, medicina y nutrición que laboran en unidades neonatales. El análisis incluyo estadística descriptiva e inferencial mediante prueba t de Student para una muestra y coeficiente de correlación de Spearman. Resultados: el instrumento mostro adecuada validez de contenido y consistencia interna. Los participantes reportaron reconocimiento general del concepto de calostroterapia; sin embargo, se identifico variabilidad en su practica, particularmente en la vía, el método, la dosis, la frecuencia y la duración, así como disponibilidad limitada de manuales, guías o protocolos institucionales. Se observo asociación significativa entre la capacitación formal y la implementación de la técnica, así como entre la existencia de lineamientos institucionales y su aplicación clínica. Conclusiones: la validación del instrumento permitió generar sustento empírico sobre la situación actual de la calostroterapia en unidades neonatales. Los hallazgos respaldan la necesidad de fortalecer la estandarización mediante capacitación estructurada y recursos operativos que orienten una practica mas homogénea, segura y basada en evidencia.