Methylobacterium radiotolerans MLP1 es una bacteria Gram negativa con alta tolerancia a cobre, aislada de la mina inactiva “La Prieta”, en Chihuahua, México. Aunque se han descrito diversos mecanismos bacterianos de homeostasis y resistencia al cobre, los mecanismos moleculares involucrados en la tolerancia de esta cepa aún no han sido completamente esclarecidos. El objetivo de este trabajo fue inferir genómicamente el resistoma de cobre de M. radiotolerans MLP1 y evaluar la participación de los genes copA1 y copA2 en los mecanismos de tolerancia al cobre mediante estrategias de mutagénesis y complementación heteróloga. Para ello, se realizó un análisis bioinformático del genoma completo de la cepa, identificando genes asociados a homeostasis metálica, particularmente ATPasas tipo P1B-1 (Cu-ATPasas), además de proteínas accesorias como copZ y el regulador transcripcional cueR. Posteriormente, se llevaron a cabo dos tipos de mutagénesis, aleatoria mediante Tn5 y sitio-dirigida por inserción de vector en los genes copA1 y copA2, así como ensayos de complementación heteróloga en cepas sensibles al cobre. Los resultados mostraron que M. radiotolerans MLP1 presenta una elevada tolerancia al cobre en comparación con otras cepas de referencia, alcanzando una concentración letal media de 4.5 mM de CuCl₂. En contraste, la mutante generada por interrupción del gen copA1 presentó una disminución significativa en la tolerancia, registrando una concentración letal media de 0.14 mM de CuCl₂. Asimismo, la expresión heteróloga de los genes copA1 y copA2 en cepas filogenéticamente relacionadas permitió incrementar la resistencia al cobre, evidenciando su papel funcional en la detoxificación metálica. En conjunto, los resultados obtenidos indican que los genes copA1 y copA2 participan de manera importante en el sistema de homeostasis y resistencia al cobre de M. radiotolerans MLP1, contribuyendo a la capacidad adaptativa de esta bacteria frente a ambientes con altas concentraciones de metales pesados. Estos hallazgos aportan información relevante para la comprensión de los mecanismos bacterianos de tolerancia a metales y representan una base potencial para futuras aplicaciones biotecnológicas orientadas a procesos de biorremediación.