Las ADN polimerasas son enzimas esenciales para la vida, responsables de la duplicación del ADN genómico durante la replicación celular, en coordinación con otras proteínas del replisoma. En este trabajo se estudió la subunidad α de la Pol III de Aquifex aeolicus (Pol-III-Aa) y una variante mutante de Escherichia coli (Pol-III-EcMut), con el objetivo de analizar y comparar sus propiedades bioquímicas, estructurales y funcionales. Para ello, se realizaron ensayos de expresión, purificación, y termoestabilidad, así como análisis mediante espectroscopía de dicroísmo circular, fluorescencia intrínseca, calorimetría diferencia de barrido y ensayos de actividad catalítica mediante qPCR. Los resultados mostraron que la Pol-III-Aa tuvo una mejor expresión en la cepa BL21 Star (DE3), bajo condiciones de baja temperatura y tiempos prolongados de inducción, mientras que la Pol-III-EcMut mostró mayor expresión y solubilidad en la cepa Rosetta (DE3), a temperaturas ligeramente más altas, tiempos de inducción más cortos y mayores concentraciones de IPTG. Las estrategias diferenciales de purificación evidenciaron propiedades bioquímicas distintas entre ambas polimerasas. En los ensayos de termoestabilidad la Pol-III-Aa mostró una mayor resistencia al calor, lo que permitió incorporar un paso adicional de purificación mediante tratamiento térmico. Los análisis de dicroísmo circular indicaron que ambas polimerasas conservan una estructura secundaria predominantemente α-helicoidal, en concordancia con su adecuado plegamiento, el cual fue también respaldado por los resultados de fluorescencia intrínseca. Por su parte, la calorimetría diferencial de barrido mostró que ambas proteínas presentan procesos de desnaturalización en múltiples etapas, y que la Pol-III-Aa posee una mayor estabilidad térmica que la variante Pol-III-EcMut. En los ensayos de actividad catalítica, no se observaron curvas de amplificación típicas bajo las condiciones evaluadas, lo que sugiere la ausencia de actividad catalítica robusta y reproducible. Esto indica la necesidad de optimizar las condiciones experimentales o emplear metodologías alternativas para evaluar de manera concluyente la actividad enzimática. En conjunto, estos resultados aportan información clave sobre la relación entre estructura, estabilidad y función en polimerasas replicativas, sentando bases para su aprovechamiento en el desarrollo de herramientas biotecnológicas.