El objetivo de la presente investigación fue evaluar el efecto antibacteriano del aceite esencial de Lippia graveolens (AELg), contra cepas multirresistentes aisladas de vacas con mastitis subclínica en unidades de producción lechera del Valle del Mezquital del Estado Hidalgo. Se determinó prevalencia de mastitis subclínica por medio de la prueba de california (CMT), en 16 unidades de producción. El aislamiento bacteriano se realizó de muestras con mastitis subclínica en Agar MacConkey y Soya Tripticaseína. Las cepas aisladas se identificaron por espectrometría de masas (MALDI-TOF). Por medio de la técnica de Kirby-Bauer se determinó sensibilidad antimicrobiana y se calculó el Índice de Resistencia Múltiple a Antibacterianos (IRMA). La actividad antibacteriana del AELg se determinó por medio de la concentración mínima inhibitoria (CMI), y bactericida (CMB), y la relación entre estas. Se determinó la citotoxicidad por medio de la prueba de hemolisis indirecta y el daño a la membrana plasmática a través de la liberación de ADN y proteínas. La composición química del aceite se identificó por cromatografía de gases acoplada a masas. La prevalencia de mastitis subclínica fue de entre 24.9 % y 47.0 % por vaca, y entre 17.2 % y 37.4 % por cuarto mamario, asociada a malas prácticas de ordeño. Se identificaron 13 especies bacterianas pertenecientes a 7 géneros, siendo Staphylococcus (36.36 %) y Enterococcus (27.27 %) los más prevalentes. El 72 % de las cepas presentaron un IRMA igual o superior a 0.5. El AELg mostró actividad antibacteriana con un efecto bactericida en las cepas evaluadas. El mayor efecto fue en bacterias Gram positivas como Staphylococcus aureus, Macrococcus caseolyticus y Enterococcus faecalis, con CMI y CMB menores a 0.1 mg/mL. Se determinó un efecto hemolítico y daño a la membrada a concentración dependiente. Se identificó al quimiotipo timol (68.9 %) como el compuesto mayoritario en el AELg. El AELg representa una alternativa contra bacterias multirresistentes; sin embargo, se requieren estudios complementarios para validar su uso en el tratamiento clínico de mastitis bovina.