La enfermedad de Chagas es una parasitosis emergente y una grave amenaza para la salud pública mundial. Es causada por el protozoario hematoflagelado Trypanosoma cruzi, transmitido por insectos triatominos (“Chinches besuconas”). En este trabajo se buscó clonar de manera eficiente cinco fragmentos de ADN:1) PpsbA, 2) TcG2, 3) IEE5, 4) TcG4 y 5) TrbcL, en el vector p320, con el fin de transformarlos posteriormente en los cloroplastos de Chlamydomonas reinhardtii. Se realizó un análisis bioinformático para diseñar oligonucleótidos que ubicaron cada gen en la posición prevista dentro de p320. Los oligonucleótidos se sintetizaron e hibridaron para generar insertos de ADN flanqueados por las secuencias necesarias, se amplificaron por PCR de punto final y se clonaron en el sitio BAMHI del plásmido p320 mediante Gibson Assembly y SLIC (Secuence and Ligation Independent Cloning). En la fase experimental se obtuvieron 11 colonias candidatas con SLIC y 8 con Gibson Assembly; tras la extracción de ADN plasmídico y su análisis por electroforesis en gel de agarosa, se observaron bandas por debajo del tamaño esperado (~4,000 pb). Por ellos, las muestras se evaluaron adicionalmente mediante digestión con XhoI y SacI, PCR y para los ensamblajes por Gibson, secuenciación. El análisis de secuencias reveló que los constructos GA 02 y GA 04 contenían los genes TcG2 y TcG4, respectivamente, mientras que PpsbA, IEE5 y TrbcL no estuvieron presentes. Estas pérdidas se atribuyen a la acción de la exonucleasa T5, que degrada los extremos 5’ para generar solapamientos 3’; si la degradación excede la región prevista o existen gaps puede producir deleciones adicionales. En conclusión, la recombinación homóloga solo permitió la inserción parcial de dos genes en p320, lo que proporcionó un punto de partida para futuros ensayos de transfección en la microalga C. reinhardtii.