La mastitis es una inflamación del parénquima del tejido de la ubre que causa cambios patológicos en el tejido glandular y anormalidades en la leche, lo que lleva a pérdidas económicas significativas para la industria lechera en México y todo el mundo. El objetivo del presente estudio fue determinar la actividad antibacteriana del aceite esencial de Rosmarinus officinalis contra bacterias asociadas a mastitis, para proponerlo como una alternativa de tratamiento. Se extrajo el aceite esencial de Rosmarinus officinalis por arrastre de vapor y se determinó su actividad antibacteriana por medio de la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI), Concentración Mínima Bactericida (CMB) y su relación de estas para determinar el efecto antibacteriano. El AER mostró actividad antibacteriana contra Escherichia coli y Staphylococcus aureus, evidenciando halos de inhibición de 11.5 mm y 13.5 mm, respectivamente. Se determino un efecto bactericida contra el 50% de las cepas evaluadas, con diferencias significativas en las concentraciones de CMI y CMB (P = 0.00001). Pseudomonas aeruginosa presenta la mayor CMI y Serratia liquefaciens mostró la menor eficacia bactericida con una relación de CMB/ CMI de 8.9. Estos resultados sugieren el potencial del AER como alternativa antibacteriana contra bacterias asociadas a mastitis resistentes a antimicrobianos convencionales, sin embargo, se requiere de estudios adicionales que identifique el metabolito que le confiere la actividad antibacteriana y garanticen su evaluación en modelos in vivo.