El almidón es una fuente esencial de energía para muchos organismos incluido el ser humano. Una fracción del almidón, denominada almidón resistente (AR), ha recibido atención especial debido a sus efectos benéficos a la salud parecidos a los de la fibra dietética. El objetivo de este estudio fue establecer las condiciones óptimas de preparación de almidón resistente retrogradado (AR III) a partir de almidón nativo de Vicia faba L. mediante la aplicación de tratamientos térmico-enzimáticos a fin de evaluar sus propiedades fisicoquímicas y nutrimentales. Se determinó la composición química de los almidones nativos (AN) mediante análisis químico proximal (AQP) y el contenido de amilosa se calculó mediante la absorción de yodo. Se desramificaron almidones de haba (Vicia faba L.) con 6, 12 y 18 unidades de pululanasa (EC 3.2.1.41) por gramo de almidón (U/g) durante 0-27 horas y se evalúo su rendimiento y contenido de AR. Para evaluar el efecto de la temperatura y el tiempo de almacenamiento en la cantidad de AR se almacenaron las muestras (desramificadas con 12 U/g durante 12 horas) a -30, 2 y 20°C durante 1-6 días. Después de obtener las condiciones óptimas de preparación de AR, se trataron almidones de haba, frijol y maíz y se compararon tanto su contenido de AR como sus propiedades. La morfología de las muestras obtenidas se analizó por microscopía electrónica de barrido (MEB) y el grado de desramificación (GD) mediante reacción con el ácido dinitrosalicílico (DNS). Se determinó el contenido de AR, almidón digerible (AD) y almidón total (AT) en las muestras nativas y tratadas, así como su digestibilidad in vitro. El análisis estadístico incluyó análisis de la varianza (ANOVA) y prueba de rango múltiple de Duncan. Se consideró un valor de p < 0.05 para establecer diferencias significativas. Para evaluar la relación entre el GD y el contenido de AR se calculó el coeficiente de correlación de Pearson (se consideró un nivel de relación significativo cuando el valor de r > 0.7). La evaluación química del AN de haba arrojó valores del 93.03 ± 0.07%, 29.20 ± 0.38% y 70.78 ± 0.00% para carbohidratos, amilosa y amilopectina, respectivamente. Se obtuvieron las mayores cantidades de AR de haba empleando: 18 U/g de pululanasa durante 27 horas de desramificación (77.12 ± 0.51%) y 6 días de almacenamiento (60.26 ± 0.04%) a 20°C (53.77 ± 0.13%). Los porcentajes de AR fueron mayores en el haba (64.88 ± 0.02) y el frijol (64.84 ± 0.13) y estadísticamente menores (p < 0.05) en el maíz (58.44 ± 0.27). Mediante MEB se pudieron observar cambios en la estructura granular después de hidrolizar y almacenar (retrogradar) los almidones de los tres especímenes. Se encontró una correlación lineal positiva entre el GD y el AR de las muestras de haba, la cual fue mayor al emplear 18 U/g de pululanasa (r = 0.949, p = 0.001). Después de los tratamientos, el AD y el AR de haba se modificaron significativamente (p < 0.05) de 77.42 ± 0.05% y 22.67 ± 0.29% a 35.21 ± 0.26% y 64.88 ± 0.02%, respectivamente. En las muestras de frijol y maíz se observaron tendencias similares. En el haba, la digestibilidad in vitro mostró diferencias significativas (p < 0.05) entre AN y AR en la concentración de equilibrio (C∞) (92.66 ± 2.00% y 84.91 ± 0.92%, respectivamente), pero no así en el índice de hidrolisis (IH) y la estimación del índice glicémico (IGe). Las mayores diferencias en el IH y en el IGe de las muestras nativas y tratadas se observaron en el maíz. Las condiciones óptimas de preparación de AR de haba fueron 18 U/g, 27 horas de incubación y 3 días de almacenamiento a temperatura de refrigeración (2°C), obteniendo un producto óptimo con el 77.12 ± 0.51% de AR.