La mastitis bovina es definida como la inflamación de la glándula mamaria es considerada como la infección más importante en las vacas lecheras, asociada con elevadas pérdidas económicas, dicha enfermedad es de carácter multifactorial, sin embargo, la etiología bacteriana la de mayor frecuencia e importancia, siendo Staphylococcus aureus y Escherichia coli los agentes de mayor prevalencia, aunado a esto el uso inadecuado de antimicrobianos ha propiciado la constante aparición de bacterias resistentes, por lo cual el objetivo del presente estudio fue aislar y caracterizar cepas bacterianas obtenidas de muestras de leche, se obtuvieron 18 muestras de dos hatos lecheros ubicados en el Estado de Hidalgo, por medio de diferentes técnicas bacteriológicas se aislaron y caracterizaron las cepas bacterianas, así mismo por medio de la técnica de difusión en disco se determinó el perfil de resistencia a antimicrobianos de 24 cepas que fueron aisladas. Los resultados obtenidos mostraron que la mayoría de los aislamientos corresponde a bacterias Gram positivas con morfología de cocos, con respecto a la sensibilidad a antimicrobianos se determinó que el 83% de las cepas fueron multirresistentes al mostrar resistencia a al menos 5 antimicrobianos. Los resultados obtenidos ponen en evidencia la necesidad de poner en práctica acciones para reducir el impacto del fenómeno de resistencia a antimicrobianos y limitar su propagación.